不同的蛋白質(zhì)分離純化的方法不同，但蛋白質(zhì)分離純化的操作步驟基本類(lèi)似，那么如何進(jìn)行細(xì)菌蛋白的提取呢？這里總結(jié)細(xì)菌蛋白的提取的實(shí)驗(yàn)試劑、操作步驟以及一些注意事項(xiàng)。
實(shí)驗(yàn)試劑
采用T7• Tag Affinity Purification Kit
T7•Tag抗體瓊脂。B/W緩沖液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl， 0.137mM NaCl，1%吐溫-20，pH7.3 洗脫緩沖液: 0.1M檸檬酸，pH2.2. 中和緩沖液：2M Tris，pH10.4。 PEG 20000。
實(shí)驗(yàn)步驟
1.100ml 含重組表達(dá)質(zhì)粒的菌體誘導(dǎo)后，離心5000g×5min，棄上清，收獲菌體，用10ml預(yù)冷的B/W緩沖液重懸。
2. 重懸液于冰上超聲處理，直至樣品不再粘稠，4℃離心 14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽濾后作為樣品液。
3. 將結(jié)合T7•Tag抗體的瓊脂充分懸起，平衡至室溫，裝入層析柱中。
4. B/W緩沖液平衡后樣品液過(guò)柱。
5. 10ml B/W緩沖液過(guò)柱，洗去未結(jié)合蛋白。
6. 用5ml洗脫緩沖液過(guò)柱，每次1ml，洗脫液用含150μl中和緩沖液的離心管收集，混勻后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。
7. 將洗脫下來(lái)的蛋白放入透析袋中，雙蒸水透析24hr，中間換液數(shù)次。
8. 用PEG 20000濃縮蛋白。
注意事項(xiàng)
蛋白在過(guò)層析柱前，要0.45μm膜抽濾，否則幾次純化后，柱子中會(huì)有不溶物。
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